Articoli Medici

Dr. Anna Maria Dall'Omo
Servizio di Immunologia dei Trapianti
Azienda Ospedaliera S.Giovanni Battista di Torino

Una valida alternativa al trapianto di midollo osseo (TMO) è stata suggerita dall’identificazione e caratterizzazione di cellule staminali emopoietiche nel sangue di funicolo ombelicale. Tali cellule, infatti, che vengono raccolte dal funicolo ombelicale nel corso del parto, sono in grado di sostenere la ricostituzione funzionale del midollo osseo nei riceventi trapiantati. Dal punto di vista clinico, i vantaggi che offre il sangue cordonale risiedono nella possibilità di effettuare trapianti incompatibili per il Sistema HLA, nella scarsa tendenza alla reattività del trapianto verso l’ospite (GVHD) e nella ridotta risposta immunitaria che dimostra possedere il sangue cordonale.

Il sangue cordonale è una risorsa particolare, prevede problemi etici del tutto caratteristici, e richiede una allocazione ottimale; di qui deriva la necessità di approfondirne le caratteristiche biologiche sia da un punto di vista scientifico, sia da un punto di vista pratico, e di sviluppare criteri di utilizzo dedicati. Prima delle scoperta delle potenzialità del sangue cordonale il funicolo ombelicale veniva considerato una res mullim priva di interesse, e scartato: il suo utilizzo, invece, ha aperto una serie di problematiche relativamente al consenso per l’utilizzo, ai propositi di procreazione mirata, ai controlli di qualità, agli aspetti di priorità tra i pazienti ed alla valutazione di eventuali interessi commerciali. Tutti questi punti sono affrontati dai sanitari nell’ottica di rispettare la volontà e la "privacy" di chi da il consenso al deposito del sangue cordonale in una Banca, e di tutelare la salute di chi riceverà il sangue cordonale stesso come trapianto. La conservazione di ogni singola unità di sangue cordonale procede da una complessa serie di analisi di qualità, che in Italia è stata protocollata, sulla base delle indicazioni EUROCORD, dal Gruppo per la Raccolta ed Amplificazione delle Cellule Emopoietiche (GRACE), che ha sede presso la Milano Cord Blood Bank. Secondo le indicazioni della legge trasfusionale, sono innanzitutto eseguiti accertamenti volti ad escludere la possibilità di trasmissione di patologie infettive. Essi sono eseguiti sul sangue cordonale e sul sangue materno, con ricontrollo dello stesso 6 mesi dopo il parto: durante tale periodo, la unità di sangue cordonale risulta "in quarantena". Un’attenta anamnesi familiare è volta ad escludere la possibilità di trasmissione di malattie genetiche. Per quel che riguarda gli aspetti quantitativi, per essere accettata in una Banca la singola unità deve rispondere a requisiti di qualità quantitativi (volume, cellularità), e deve essere sterile. Deve soddisfare altresì requisiti di funzionalità particolari. Un particolare aspetto di qualità, la contaminazione materno-fetale, richiede un’analisi dedicata: si tratta fenomeno fisiologico, che consiste nella persistenza di cellule di origine materna nel sangue del funicolo ombelicale. Le cellule materne possono trasferire al ricevente di un trapianto di sangue cordonale infezioni latenti (a questo problema si ovvia controllando la madre a 6 mesi dal parto) e, teoricamente, possono sostenere la GVHD. Questa problematica è stata presa in esame da vari gruppi con tecniche diverse che consentono di identificare, con diversi gradi di sensibilità, la presenza di materiale materno nel sangue cordonale: la percentuale di unità di sangue cordonale contaminate varia pertanto a seconda della tecnica utilizzata. I risultati delle analisi di contaminazione materno-fetale sono da correlare con l’incidenza di GVHD nella casistica di trapianti da sangue cordonale, che è nettamente inferiore, pur trattandosi prevalentemente di trapianti incompatibili, a quella riscontrata nella casistica di TMO: questo dato suggerisce la possibilità che il sangue cordonale raccolto con cura contenga un numero biologicamente non significativo di linfociti materni, probabilmente inattivi nel contesto del sangue cordonale. La tipizzazione degli antigeni HLA, infine, necessaria affinchÈ l’unità sia selezionata a favore di uno o più pazienti, viene eseguita su un’aliquota di sangue cordonale. Dal punto di vista pratico, per ottenere i migliori risultaci, si utilizzano tecniche sierologiche e/o di biologia molecolare per tipizzare gli antigeni HLA-A e B, mentre sono raccomandate tecniche di biologia molecolare per tipizzare gli alleli HLA-DRB1. Vengono inoltre conservati campioni "satelliti" di ogni singola sacca (frammento di funicolo/campione di villi, campione di sangue materno), per eventuali test di conferma da eseguirsi in un secondo tempo, dopo la selezione.La possibilità di effettuare trapianti parzialmente incompatibili per il Sistema HLA implica da un lato la possibilità che un paziente trovi più facilmente un donatore, e dall’altro che una stessa unità sia selezionata per più di un paziente. Recenti analisi, hanno consentito di calcolare teoricamente che per ogni singolo paziente le opportunità di reperire un donatore non identico aumentano sensibilmente, anche se si dispone di gruppi numericamente piccoli (ricordiamo a tale proposito che il Registro Mondiale dei donatori di Midollo BMDW registra attualmente circa 5 milioni di donatori, contro circa 15.000 unità di sangue cordonale). La differenza è particolarmente evidente nei pazienti con fenotipo HLA raro, per cui risulterebbe impossibile trovare un donatore compatibile: 55% di questi pazienti troverebbe infatti un donatore nel pool di SC. Questo rilievo permette di concludere che le banche di sangue cordonale vanno sostenute, ampliate e particolarmente corredate dall’inserimento di fenotipi HLA rari (minoranze etniche). La possibilità che una singola sacca sia assegnata a un paziente incompatibile per HLA, implica che la stessa unità sia individuata per più di un paziente: questa eventualità, unita alla "pronta disponibilità" di ogni unità di sangue cordonale, ed alla coesistenza di molte Banche di sangue cordonale, complica i problemi di allocazione. Al fine di semplificare ed ottimizzare le procedure di ricerca di una unità di sangue cordonale, dal 1997, in seno all’Eurocord, si è istituito un collegamento informatico (NETCORD), in cui al momento condividono i dati le banche di Barcellona, Duesseldorf e Milano e la cui consultazione, per l’ematologo alla ricerca di una prospettiva di trapianto per un proprio paziente, è accessibile via "lnternet". Si auspica per il futuro di poter accedere al riferimento delle unità di direttamente, tramite il BMDW, con la creazione di programmi dedicati alla possibilità di selezionare donatari di midollo non imparentati identici e/o multiple unità di sangue cordonale incompatibili.

La rete italiana di Banche di Sangue Placentare GRACE e i programmi di collaborazione internazionale

Prof. Girolamo Sirchia
Direttore, Milano Cord Blood Bank
Direttore Generale, NETCORD
Centro Trasfusionale e di Immunologia dei Trapianti -IRCCS Ospedale Maggiore Milano

Per alcune categorie di pazienti in attesa di trapianto di midollo, il sangue placentare rappresenta una valida sorgente di cellule staminali emopoietiche (le cellule da cui originano tutte le cellule del sangue), che si affianca alla sorgente tradizionale, rappresentata dal midollo osseo. La fase sperimentale dedicata all’impiego di tale forma di trapianto si sta concludendo, alla luce dei promettenti risultati raccolti in oltre 500 trapianti di sangue placentare già effettuati nel mondo. l tempi sono quindi maturi per consolidare i programmi di bancaggio del sangue placentare avviati in numerosi Paesi. Tali programmi, che sono spesso molto validi sotto il profilo scientifico, sono spesso frammentati in numerose strutture. La mancanza di un coordinamento di queste attività non favorisce la tempestività di reperimento delle unità compatibili per i pazienti che ne hanno bisogno.

Per questi motivi l’organizzazione internazionale del trapianto di cellule staminali da sangue placentare sta evolvendo verso la creazione di reti operative (network nella terminologia anglosassone) che dispongano di centri di riferimento nazionali (o centri di riferimento di ampie aree geografiche) a supporto di un network nazionale di banche, ognuna responsabile di uno o più centri di raccolta. In Italia questo schema organizzativo (figura 1) è stato avviato nel 1995 dalla Milano Cord Blood Bank con la creazione del network GRACE (Gruppo per la Raccolta e l’Amplificazione delle Cellule Emopoietiche), che opera all’interno del Gruppo Italiano Trapianto di Midollo Osseo (GITMO) e del programma europeo EUROCORD. Obiettivo principale di GRACE è raggiungere in 5 anni un inventario globale di 20.000 unità di sangue placentare che offrano caratteristiche di qualità uniformi e predefinite. Per raggiungere tale obiettivo i membri di GRACE partecipano a incontri periodici finalizzati a concordare protocolli operativi comuni e ad eseguire ricerche collaborative inerenti il prelievo, la caratterizzazione, la criopreservazione e il trapianto di cellule staminali da sangue placentare. GRACE ha già definito un protocollo per la raccolta, caratterizzazione, conservazione e impiego clinico delle cellule staminali da sangue placentare, in accordo con GITMO e con l’Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica (AIEOP). Questo protocollo, che è in vigore dal 1° gennaio 1997, descrive i principali aspetti metodologici, nonchÈ le indicazioni al trapianto di sangue placentare. Il protocollo fornisce inoltre indicazioni relative ai Centri Trapianto che possono accedere all’uso di unità di sangue placentare del network. Tali indicazioni sono conformi a quanto deliberato dal GITMO per il trapianto di cellule staminali da donatore non consanguineo, a sua volta conforme con i criteri adottati dall’EBMT. In merito ai livelli di compatibilità accettati, il protocollo recepisce l’orientamento generale di perseguire la migliore compatibilità possibile, consentendo il trapianto fino ad un massimo di due diversità antigeniche ad alta risoluzione per HLA A, B, DRB1. Il protocollo fornisce infine linee guida per i regimi di condizionamento, la profilassi della GVHD (la malattia da trapianto contro l’ospite), la terapia di supporto e la raccolta e trasmissione dei dati. Il programma della qualità sviluppato da GRACE per il bancaggio del sangue placentare ha avuto avvio con l’identificazione di un gruppo iniziale di 7 banche: Milano, Bologna, Firenze, Padova, Roma La Sapienza, Roma Tor Vergata, Torino.

Milano Cord Blood Bank ha coordinato le azioni necessarie a favorire lo sviluppo dei sistemi qualità presso ognuna delle 7 banche. Questi sistemi sono stati sviluppati in analogia al sistema qualità di Milano Cord Blood Bank, la cui conformità allo standard ISO 9002 è stata certificata in luglio 1997. Per ‘sistema qualità’ si intende la struttura organizzativa, le procedure, i processi e le risorse necessarie per assicurare la qualità della raccolta, caratterizzazione e criopreservazione del sangue placentare.

Il sistema si basa sullo standard ISO 9002, un modello di assicurazione qualità relativo alla produzione, installazione e manutenzione sviluppato nel 1987 e aggiornato nel 1994 dall’International Organization for Standardization. ISO 9002, applicato in oltre 80 Paesi inizialmente all’industria e più recentemente alla sanità, è composto da 20 clausole che costituiscono la guida per l’implementazione del sistema qualità (tabella 1). Si tratta di clausole valide per ogni tipo di organizzazione o azienda, indipendentemente dal tipo di attività svolta. Come si può notare dalla tabella 1, la prima clausola indica l’importanza che questi programmi siano compresi, impostati e sostenuti con adeguate risorse dall’alta direzione: è necessario quindi in prima istanza un adeguamento culturale dei dirigenti e di tutti gli operatori di fronte alle problematiche della qualità, senza il quale la certificazione ISO 9002 è solamente un adempimento formale.

Le 20 clausole ISO 9002

4.1    Responsabilità della Direzione
4.2    Sistema qualità
4.3    Riesame del contratto
4.4    Controllo della progettazione (non applicabile)
4.5    Controllo dei documenti e dei dati
4.6    Approvvigionamento
4.7    Controllo del prodotto fornito dal cliente
4.8    Identificazione e rintracciabilità del prodotto
4.9    Controllo del processo
4.10 Prove, controlli e collaudi

4.11 Controllo delle apparecchiature per prova, misurazione e collaudo
4.12 Stato delle prove, controlli e collaudi
4.13 Controllo del prodotto non conforme
4.14 Azioni correttive e preventive
4.15 Movimentazione, immagazzinamento, imballaggio, conservazione e consegna
4.16 Controllo delle registrazioni della qualità
4.17 Verifiche ispettive interne delle qualità
4.18 Addestramento
4.19 Assistenza
4.20 Tecniche statistiche

Tabella 1

Fase 1
Il Direttore Medico della banca definisce un Piano Generale della Qualità, che include (1) la descrizione scritta della Mis-sione, degli Obiettivi, delle Direttive tecniche ed organizzative, dell’Organigramma della banca; (2) la definizione e l’acquisizione di adeguate risorse finanziarie, umane e strutturali; (3) l’identificazione di un Responsabile della Qualità indipendente dal laboratorio di produzione, che dipende gerarchicamente direttamente dal Direttore. Il Responsabile della Qualità deve: (1) definire il processo di bancaggio in collaborazione con il personale della banca; (2) avviare un piano documentale finalizzato alla produzione e manutenzione dei seguenti documenti: (a) il Manuale della Qualità, scritto dal Responsabile della Qualità, che descrive in modo conciso come la banca opera con un sistema qualità conforme alle clausole dello standard ISO 9002; (b) le Procedure Generali (o Procedure del Sistema Qualità), redatte sotto la responsabilità del Responsabile della Qualità, che forniscono maggiori dettagli su alcune clausole, secondo quanto prescritto dallo standard ISO 9002; (c) le Procedure Operative (o Procedure di Processo), redatte sotto la responsabilità del personale della banca, che descrivono in dettaglio il processo di bancaggio e le modalità di esecuzione delle tecniche ad esso relative; (d) le Istruzioni Operative, che contengono i passaggi successivi delle diverse attività; (e) i Moduli e le Tabelle per la raccolta e la registrazione dei dati del processo di bancaggio e del sistema qualità; (3) identificare indicatori della qualità; (4) definire un programma periodico di verifiche ispettive interne; (5) sottoporre i risultati delle verifiche ispettive interne al periodico riesame della Direzione.

Fase 2
Definizione del mansionario, educazione, aggiornamento e qualificazione del personale.

Successivamente al lancio del sistema qualità, la banca viene sottoposta a verifica da parte di un ispettore esterno e, in caso di esito favorevole di tale verifica, riceve una certificazione di conformità allo standard ISO 9002. Il sistema qualità deve essere mantenuto nel tempo e sottoposto a periodiche verifiche ispettive esterne onde consentire la conferma della certificazione. In conformità con il programma appena descritto, il Direttore di ognuna delle 7 banche di GRACE ha identificato un responsabile della qualità, che ha partecipato nel 1996-1997 a un corso formativo semestrale sulla qualità finanziato con un contributo dell’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC). Questo corso rappresenta la base del processo formativo e organizzativo finalizzato ad ottenere la certificazione ISO 9002. All’interno di questo programma, ogni responsabile della qualità ha redatto il manuale della qualità e avviato la realizzazione del piano documentale. Presso ogni banca sono stati quindi avviati programmi di aggiornamento del personale per consentirne una corretta qualificazione in relazione all’attività svolta (prelievo, citometria, colture cellulari, criopreservazione, sierologia, ecc.). A seguito di queste attività è stato predisposto un programma di verifiche ispettive interne, volto a verificare eventuali carenze del sistema. Le fasi finali del programma includono il lancio del sistema qualità e la richiesta formale di certificazione, che è prevista avvenire entro l’autunno 1998.

L’organizzazione sviluppata da GRACE genera a livello nazionale numerosi vantaggi. Infatti, ogni banca ha la possibilità di accedere alle richieste dei clinici e quindi di contribuire a soddisfare il fabbisogno dei pazienti anche con un inventario limitato. Inoltre, ogni banca è inserita, senza addizionali aggravi economici, all’interno di un sistema qualità certificato, che può rappresentare un primo nucleo di un sistema qualità più vasto, trasferibile alla struttura all’interno della quale opera la banca. Infine, la partecipazione a un network che opera con un unico sistema qualità rappresenta un elemento di garanzia dei prodotti della banca e conferisce quindi ‘visibilità’ alla banca. Dal momento in cui il network GRACE avrà conseguito la certificazione ISO 9002, le banche partecipanti a GRACE, che useranno modulistica e procedure tecniche uniformi, opereranno secondo un’organizzazione che prevede le seguenti modalità. Le banche inviano i dati relativi alle proprie unità disponibili alla Milano Cord Blood Bank, che funge da punto di accesso centralizzato delle richieste di unità di sangue placentare attivate dai clinici. Milano Cord Blood Bank esplora l’archivio del network e, se identifica unità compatibili, ne riporta le caratteristiche al clinico, che sceglie l’unità che ritiene più idonea e prende contatti direttamente con la banca presso la quale tale unità è conservata. Il Centro Trapianti si impegna a rendere a Milano Cord Blood Bank i dati relativi all’esito del trapianto. Tali dati vengono trasmessi da Milano Cord Blood Bank alla banca che ha fornito l’unità impiegata per il trapianto. Inoltre, Milano Cord Blood Bank trasmette i dati di GRACE al registro italiano IBMDR di Genova e al registro internazionale Bone Marrow Donors Worldwide (BMDW) di Leida, nonchÈ ad altri network e organizzazioni internazionali che operano per consentire il reperimento di cellule staminali allogeniche a scopo di trapianto, fra cui NETCORD, un network internazionale che riunisce le banche di D¸sseldorf, Milano, Barcellona e Londra e che si è formalmente costituito in Associazione senza fine di lucro nel maggio 1998. Le caratteristiche di NETCORD, il cui logo è riportato nella figura 2, e il cui schema organizzativo, analogo a quello di GRACE, è riportato nella figura 3, sono le seguenti. Ogni banca dispone di un inventario accessibile on line alle altre tre banche via Internet. Quando una delle quattro banche riceve una richiesta, esplora l’intero inventario ed invia una risposta al Centro Trapianto che include anche unità compatibili eventualmente presenti nelle altre banche. Questa risposta riporta le unità per livello di compatibilità HLA e, all’interno di ogni livello, per numero di cellule contenute nelle unità. Se vengono identificate più di 1 unità compatibili NETCORD offre un servizio di consulenza atto a facilitare la selezione dell’unità più conveniente da parte del clinico. Il Centro Trapianti identifica l’unità da riservare per il paziente in oggetto e attiva gli ulteriori necessari contatti direttamente con la banca presso cui l’unità è conservata. Conformemente a quanto previsto dallo statuto dell’associazione, NETCORD può ampliare il proprio inventario ad altre banche, purchÈ dotate di analoghi sistemi qualità e di un adeguato sistema per consentire la circolazione delle informazioni e l’attivazione delle ricerche.

Le premesse ci sono tutte perchÈ lo sforzo organizzativo avviato nel 1995 con la creazione del network italiano GRACE e nel 1998 con lo sviluppo di NETCORD cominci a dare i suoi frutti quanto prima: pensiamo non solo a tempi brevi di risposta ai clinici, e quindi a tempi più brevi per il trapianto, ma anche e soprattutto alla condivisione a livello nazionale e internazionale del grande patrimonio di unità donate dai piccoli donatori di sangue placentare di cui oggi disponiamo, la cui qualità è garantita dalla certificazione ISO 9002 del nostro programma.

Non possiamo concludere senza ringraziare le mamme e i papà di questi piccoli donatori. Contiamo sul supporto dei volontari che hanno compreso l’importanza del nostro lavoro e lo sostengono con loro consenso e con le loro azioni.

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